一、觀察及儀器操作
1. 開啟儀器電源及光源
一般先開啟顯微鏡和激光器，再啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，然后啟動(dòng)操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube，PMT)檢測器能得到足夠的信號(hào)結(jié)果。使用汞燈的注意事項(xiàng)同普通熒光顯微鏡。
2. 設(shè)置相應(yīng)的掃描方式
在目視模式下，調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細(xì)胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。
3. 獲取圖像
選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。
4. 關(guān)閉儀器
儀器測定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分，計(jì)算機(jī)仍可繼續(xù)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計(jì)算機(jī)及總開關(guān)。
二、獲取三維圖像
激光掃描共聚焦顯微鏡具有細(xì)胞“CT”功能，因此，它可以在不損傷細(xì)胞的情況下，獲得一系列光學(xué)切片圖像。選用“Z-Stack"模式，即可實(shí)現(xiàn)此項(xiàng)功能。
1. 開啟“Z-Stack”選項(xiàng)。
2. 確定光學(xué)切片的位置及層數(shù)。
3. 啟動(dòng)“Start”，獲得三維圖像。
三、獲取時(shí)間序列圖像
共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能，可以自動(dòng)在實(shí)驗(yàn)者規(guī)定的時(shí)間內(nèi)按照設(shè)定的時(shí)間間隔獲取圖像。只需設(shè)定所需的時(shí)間間隔以及所需圖像數(shù)量，開啟“Start T”功能鍵，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。“Time-Series”功能大大減輕了實(shí)驗(yàn)者的勞動(dòng)強(qiáng)度，對于熒光漂白恢復(fù)和鈣離子成像等實(shí)驗(yàn)非常實(shí)用。
注意事項(xiàng)1. 儀器周圍要遠(yuǎn)離電磁輻射源;
2. 環(huán)境無震動(dòng)，無強(qiáng)烈的空氣擾動(dòng);
3. 室內(nèi)具有遮光系統(tǒng)，保證熒光樣品不會(huì)被外源光漂白;
4. 環(huán)境清潔;
5. 控制工作溫度在5～25℃。
